1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
小麦是世界上栽培最广的粮食作物，在我国小麦的栽培面积仅次于水稻，对人民的物质生活具有重要影响。随着人口增长，对粮食的需求日益增加。与此同时，人民生活的日益丰富，食品加工业需要大量的小麦作为加工原料。通过选育高产优质多抗的小麦品种是小麦育种的关键，但是小麦的亲本品种过于集中，遗传基础狭窄，限制了小麦品种产量和抗性的突破进展。二倍体簇毛麦作为小麦的近缘野生种，具有许多重要的农艺性状，它几乎对全部的白粉病生理小种表现高抗或免疫，高抗叶锈和杆锈，对全蚀病、眼斑病、黄花叶病及其病毒传媒瘿螨等多种病虫也都具有抗性（王春梅等，2007；李桂萍等，2007），并且还具有抗寒、耐旱、分蘖力强、小穗数多和籽粒组蛋白质含量高等多个优良性状，因此，已经成为小麦遗传改良的重要基因资源。小麦细胞遗传学、分子生物学等现代生物技术的发展应用与理化诱变技术的有机结合，为外源有益基因的导入，创造新的小麦遗传资源提供了理论依据与技术支撑。通过远缘杂交将这些物种中的优良基因采用染色体工程途径导入普通小麦，既可以丰富小麦遗传基础，又不涉及转基因安全性等问题，是推进小麦育种取得突破性进展的有效途径(jiang 等,1994；friebe等, 1996)。由于异附加系或异代换系细胞学仍不稳定，表型上也有许多簇毛麦的野生特性，只有创造带有较少外源冗余基因的易位系才有可能应用于小麦的品种改良。通过染色体工程创造携有目标基因的易位系，尤其是小片段易位系，由于所转移的是来自亲缘植物的一小段染色体，不存在转基因安全性争议，在转移结构基因的同时通常还伴有其原有的表达调控区段，因此它们在转入受体品种后，目标基因的表达程度高、稳定性好、传递力强。
事实证明，创造和利用携有外源有利基因的易位系可以用于小麦的育种，例如，以南京农业大学创造的小麦-簇毛麦6vs/6al易位系作亲本，已有二十余个抗病高产品种通过审定并大面积推广（李桂萍等，2007）。在自然界中，小麦的异易位系可以通过自发产生，遗传补偿性较好，但是发生频率低，而且基本是与小麦亲缘关系较近的物种。簇毛麦与小麦的亲缘关系较远，很难通过自发的部分同源重组产生易位。对于这类不能通过一般的配对重组与小麦产生易位的物种，可以通过染色体配对控制体系的调节操纵（ph系统）、外源杀配子染色体诱发染色体断裂重接、电离辐射、组织培养等方法（徐惠君等，1996；crasta等，2000；袁建华等，2003；chen等，2005；bie t d 等，2007；qi等，2008曹亚萍等，2011）。zhang 等（2010）从硬簇麦与中国春的辐射回交后代中选育出易位系t5vs5dl 。li等（1999，2005）利用组织培养也得到了一个抗白粉病易位系6vs/6dl。利用杀配子染色体诱导或phi诱导，南京农业大学细胞遗传所还得到了涉及簇毛麦2v的易位系，根据易位系和2vs、2vl两个端体系的表型，将控制簇毛麦颖脊刚毛的基因定位到2vs上（李淑梅，2009）。通过部分同源配对控制体系已获得了涉及黑麦属、山羊草属、偃麦草属、大麦属、簇毛麦属等亲缘物种与小麦之间的染色体易位系。利用ph系统诱导易位的最大优点就是易位事件一般发生在外源染色体和小麦中与之具有部分同源关系的染色体之间，可以获得遗传补偿能力较好的易位系。
根据研究报道，簇毛麦6v染色体长臂上具有抗孢囊线虫病基因（阎乃红等 2003）、抗秆锈病新小种ug99的基因（qi et al.,2011）、抗小麦条斑病毒病（wsmv）的传媒瘿螨基因（chen et al.,2006），可用于小麦品种的改良。本研究利用已有的小麦-簇毛麦t6as6vl易位系，通过这些材料与促进同源配对控制体系材料杂交，在自交后代中借助分子细胞遗传学和分子标记分析，筛选不同类型的涉及6vl染色体的结构变异系，为今后创造出更多的携有抗孢囊线虫病基因、抗秆锈病新小种ug99的基因和抗小麦条斑病毒病（wsmv）的传媒瘿螨基因的小片段易位系奠定基础。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
以小麦-簇毛麦t6as6vl易位系作为母本，中国春作为父本杂交后自交获得的f2进行细胞学鉴定，获得涉及簇毛麦6v染色体长臂的不同片段大小的纯合或杂合易位系，为进一步挖掘和定位6v染色体长臂上的优异基因奠定基础。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法：
1、 利用ph1b隐性纯合突变体材料诱导普通小麦－簇毛麦部分同源染色体配对
小麦-簇毛麦T6AS6VL易位系(ph1bph1b）与中国春(ph1bph1b）杂交,获得的杂种F1中，减数分裂时期一条T6AS6VL易位系的染色体与另一条正常的6AS.6AL染色体在ph1bph1b的诱导下，6VL与6AL的同源部分发生重组，创制涉及簇毛麦6V染色体长臂的不同片段大小的结构变异系。
2、利用分子原位杂交技术检测涉及6VL染色体的变异系
基因组荧光原位杂交（GISH）（Friebe et al,1992,1993a;Jiang et al,1993a;Gill et al,1993b;Islam-faridi er al,1995):用簇毛麦总基因组DNA作探针进行GISH，检测簇毛麦染色体。
分子标记开发,本研究依据定位于小麦第六部分同源群染色体长臂不同区段的EST序列设计引物，利用中国春、簇毛麦、硬粒小麦、硬簇麦、6VL/6AS易位系，6AL/6VS易位系筛选多态性的EST-PCR引物，挑选出可能与簇毛麦6VL染色体长臂相关的引物
技术路线：
中国春ph1bph1b |
F1 ph1bph1b |
F2后代结构变异体的鉴定（原位杂交和分子标记鉴定） |
获得片段大小不同的涉及6VL染色体的纯合易位系 |
小麦-簇毛麦T6AS.6VL整臂易位系ph1bph1b |
实验方案：
1、 F1植株所结的种子，分单株收获，晒干，编号贮藏。
2、 将获得的种子进行发芽。在培养皿中铺上两层滤纸，加入适量水，泡种至种子露白即可摆种，然后在适宜温度下培养。
3、 剪根，根长到1-2cm时进行剪根，剪根后放入冰水中冰浴22-24h
4、 固定，将冰浴好的跟放入配好的固定液（无水乙醇：冰醋酸=3:1）中进行固定，固定时间应该大于六小时。
5、 制片，去掉根冠，切取根尖分生组织，滴一滴45%的醋酸，然后盖片，在酒精灯上将片子烤至有云雾状，压片。将片子标记好，存入-70℃冰箱中。
6、 脱水，在脱水缸中，片子脱水适当时间，在显微镜下镜检，若所得的有丝分裂中期较为集中且染色体分散则保留。
7、 将保留的片子进行原位杂交。
8、 在荧光显微镜下观察，筛选和鉴定出涉及6VL的纯合易位系
可行性分析：
南京农业大学细胞遗传所利用染色体工程手段已经培育了一套小麦-簇毛麦整套二体异附加系DA1V至DA7V、硬簇麦以及T6AS6VL和T6AL6VS补偿性易位系。本试验的材料是利用Ph系统诱导小麦与簇毛麦具有部分同源性的部分进行重组而产生易位，已经获得F2群体，而且本实验室已利用该方法已成功获得片段大小不同的涉及4VL的纯合易位系，试验技术十分成熟有效，可以借鉴！
4. 研究创新点
在小麦的野生近缘属中，簇毛麦与小麦的亲缘关系相对较远，利用远缘杂交获得小片段的纯合易位系较少，而且关于6VL的研究极其少。通过筛选和鉴定涉及有6VL的纯合易位系，创制出含优质基因的小麦的种质资源。
5. 研究计划与进展
研究计划：
2013.7-2013.8 理论课学习、明确实验思路、学习并掌握基本的实验技术。
2013.9-2013.12 将需要鉴定的种子材料，进行发芽、剪根、制片、原位杂交、镜检获得涉及6vl的纯合易位系，将含有目标片段的单粒种子移苗。
