1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
产酶溶杆菌（Lysobacter enzymogenes）属于黄单胞科（Xanthomonadaceae）溶杆菌属（Lysobacter），是一种重要的生防细菌[1]。该菌G C含量较高，有滑行能力，能产生多种胞外酶，包括几丁质酶、蛋白酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶，对多种植物真菌和卵菌病害具有较好的防治效果。菌株OH11是本课题组从辣椒根际土壤中分离获得的一株生防细菌，是国内首次报道的一株产酶溶杆菌菌株。该菌株对多种植物病原真菌、卵菌、革兰氏阳性细菌以及线虫均具有显著的拮抗作用[2][3][4]。在温室和田间的生防试验中，该菌株也能对多种植物真菌病害（如小麦赤霉病、稻瘟病、梨炭疽病、卵菌病害（如辣椒疫病）及部分细菌病害（如番茄青枯病）表现出较好的防治效果[5][6][7]。产酶溶杆菌易于培养、发酵和保存，防效稳定，对环境友好，是一种具有应用前景的生防细菌[8]。
目前，产酶溶杆菌的生防机理主要归纳为：（1）分泌产生大量胞外酶，包括几丁质酶、b-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、磷酸酶，能降解真菌、卵菌等微生物的细胞壁；（2）产生次生抗菌物质，如从产酶溶杆菌C3及OH11菌株中鉴定的新型热稳定抗菌物质HSAF（Heat Stable Antifungal Factor）和抗革兰氏阳性细菌的物质WAP-8294A2[9][10]；（3）在植物上定殖和抗生[11]；（4）诱导抗病性[12]。
过去（2006年以前），产酶溶杆菌生防机理的研究多数集中在该菌胞外水解酶的纯化、活性测定、编码基因与调控基因克隆及生防功能评价等方面，很少涉及该菌次生抗菌物质的分离鉴定等工作。2006年以来，研究人员从产酶溶杆菌C3和OH11菌株中分离了一种称为HSAF的次生抗菌物质[13]。该物质对蛋白酶不敏感，对热极其稳定。结构鉴定表明： HSAF的分子量为513.2959，其结构中含有一个独特的大环内酰胺体系和一个四胺酸结构单元和5,5,6-三环骨架，这一结构与目前市场上所有的杀真菌剂的结构均不一致。在作用活性方面，低浓度的HSAF（20 g/mL）可以使病菌孢子萌发后呈畸形或使菌丝分支出现紊乱，而高浓度的HSAF（40 g/mL）则完全抑制病菌孢子的萌发和菌丝的生长[14]。在植物上，HSAF可以抑制病原真菌附着孢的形成，从而减少病害的发生，降低危害程度。此外，目前已经初步明确HSAF对病原真菌的作用方式主要是通过抑制病菌神经酰胺合成酶（ceramide synthase）活性, 改变丝状真菌细胞膜中的鞘脂类化合物（sphingolipids）的组成（鞘脂是真核细胞膜和细胞分子必不可少的组成成分），从而影响真菌菌丝的极性生长，这一作用方式是新型的，与目前已报道的商用杀真菌剂的作用方式截然不同。更为重要的是，HSAF虽可识别不同类型的鞘脂，但只对丝状真菌有抑制活性，对哺乳动物和植物不起作用。因此，HSAF可以代表一类具有新型结构和独特作用方式、对环境友好的生物杀菌剂。目前，本课题组已完成了产酶溶杆菌OH11全基因组测序工作。在此基础上，与合作者共同明确了基因组中HSAF合成基因簇的结构，生物合成所需的关键基因种类与数量，以及在体内独特的生物合成方式。
在HSAF研究的基础上，本课题组近期与合作者又从产酶溶杆菌OH11菌株从分离纯化了一种称为WAP的物质。该物质为一种环肽类结构的化合物，对马铃薯环腐病菌等植物病原革兰氏阳性细菌具有较强的抑制能力。同时，该物质对感染人类的金黄色葡萄球菌也具有较强的作用活性，与市场上常用的抗生素即万古霉素相比其作用活性提高了近50倍。目前，本课题组与合作者已完成了产酶溶杆菌中WAP生物合成基因簇的结构分析，明确了生物合成所需的关键基因种类与数量，为利用微生物发酵工程开发基于WAP-8294A2的杀菌剂或抗菌药物奠定基础。
生物体中广泛存在着一类核苷酸，他们能够通过感应细胞外环境变化从而调控多种生物学功能。在细菌中，一些被称作第二信使的环化核苷酸，如c-di-GMP（环二鸟苷酸）, c-di-AMP（环二腺苷酸）, cGMP（环鸟苷酸）, cAMP（环腺苷酸）等，在生物膜形成、菌体的运动能力、病原菌的致病能力等方面具有重要的调控作用。
环化酶是第二信使生物合成的关键酶。含有GGDEF结构域的蛋白具有鸟苷酸环化酶(DGCs)的活性，负责c-di-GMP的合成；而腺苷酸环化酶(ACs)含有CyaA结构域，负责合成cAMP。基因组扫描发现，产酶溶杆菌OH11中含有2个基因，代号分别为lys0384和 lys0385，其中 lys0385含有GGDEF结构域和一个cNMP_binding结构域；而 lys0384含有CyaA结构域，揭示这两个基因所编码的蛋白可能参与c-di-GMP和cAMP的生物合成。 |
为此，本研究将综合运用生物信息学、基因组学、分子生物学等手段，研究lys0384和 lys0385在产酶溶杆菌中的生物学功能，重点分析这两个基因在产酶溶杆菌OH11抗菌物质（HSAF和WAP-8294A2）合成中的功能。研究结果对后续通过基因改良，提高HSAF和WAP-8294A2的产量，开发基于HSAF和WAP-8294A2的生物农药和抗菌药物具有重要的理论和应用意义。
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2. 研究的基本内容和问题
目标：基因 lys0384， lys0385在产酶溶杆菌中的生物学功能，重点分析这两个基因在产酶溶杆菌OH11抗菌物质HSAF和WAP-8294A2合成中的功能 内容：（1）lys0384和 lys0385基因的克隆、敲除与互补； （2）通过表型（如胞外酶、HSAF体内合成等）测定，明确lys0384和 lys0385两个基因的生物学功能。 |
拟解决的关键问题： c-di-GMP和cAMP在产酶溶杆菌中抗菌物质生物合成中的调控功能。
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 研究方法：采用细菌学、分子生物学、生物信息学等。 技术路线： PCR扩增 lys0384和 lys0385上下游基因片段
酶切、连接构建重组载体 重组载体导入野生型OH11 筛选一次交换子 筛选二次交换子获得缺失突变体 构建互补载体 表型验证 实验方案： （1）构建重组载体 通过PCR获得同源片段上下游片段，酶切连接到PEX18质粒上； （2）获得一次交换子 将重组质粒导入野生型细菌，利用质粒抗性筛选得到一次交换子； （3）筛选二次交换子 利用质粒上的特殊基因，用特定的选择培养基得到二次交换子，通过PCR筛选缺失突变体； （4）验证突变菌株生防功能及对胞外酶和HSAF分泌的影响； （5）构建互补菌株及验证其功能。 |
可行性分析：
（1）实验材料完备：本实验室已有产酶溶杆菌OH11，自杀载体pEX18Gm，大肠杆菌TOP10菌株。
（2）实验技术成熟：所在实验室在基因敲除方面具备较为完善的实验方案和成熟的技术。 |
（3）实验仪器、设备齐全。
4. 研究创新点
探索第二信使对产酶溶杆菌生防性状的调控功能。
5. 研究计划与进展
（1）2013年8月 载体的构建； （2）2013年9月 目标突变菌株的获得及功能验证； （3）2013年10月 互补菌株的构建及功能验证。 |
