1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
热应激是指在高环境温度中的机体对热环境所做的非特异性的生理反应的总和[1.2]。随着全球变暖，热应激已成为危害畜牧生产的重要因素之一，近年来国内外学者对热应激进行了大量的研究，主要包括：热应激对奶牛产奶量的影响、对乳品质的影响、对奶牛生理指标的影响、对奶牛采食量和消化的影响、对激素代谢的影响以及对繁殖性能的影响等。
虽然当今对缓解热应激已有不少措施，但是在热应激对基因表达上更深层次的影响还有待研究探索。在此方向定能有所突破，用于大大缓解热应激带来的不良影响。有报道表明在热应激期间荷斯坦奶牛产奶量下降，而下降的采食量和管理因素可以部分解释热应激期间降低的产奶量[3,4]。一些研究还表明，热应激期间乳腺上皮细胞 rna 转录和翻译受到抑制，如细胞周期，膜通透性也受到了影响[5,6]。
同时，热应激还影响奶牛乳腺的泌乳性能。有研究表明，奶牛受到热应激后代谢紊乱，使机体处于能量负平衡状态。此时测得热应激奶牛血清中脂联素和 ampk 活性增加[7]。在负能量刺激下，雷帕霉素靶蛋白复合体 1（mtorc1）活性降低，进而造成细胞基因转录及生物合成代谢紊乱[8,9]，最终影响奶牛乳腺泌乳性能。还有研究推测热应激可能并不是通过调控单个乳腺细胞合成乳蛋白的能力来影响乳蛋白的含量和产量，而是通过诱导乳腺细胞的凋亡，减少可用于乳蛋白合成的乳腺细胞的数量，进而来影响乳蛋白的含量和产量[10]。还有从乳腺细胞的另一种程序性死亡——自噬的角度来进行研究。正常情况下，自噬是保持细胞稳态的关键机制。而在热应激条件下，干奶期奶牛乳腺细胞被诱导发生自噬，导致细胞损伤，进而干扰了细胞最佳增殖期的乳腺再生，引起泌乳性能降低[11]。
2. 研究的基本内容和问题
2.1 研究目标
1)培养较高纯度奶牛乳腺上皮细胞；
2)了解热应激对奶牛乳腺上皮细胞泌乳相关基因的潜在影响；
3. 研究的方法与方案
3.1 研究方法
1) 乳腺上皮细胞的培养
外科手术法釆取乳腺组织。用含有双抗的 pbs 液多次冲洗，置于含有双抗的 dmem 培养液中,运至实验室备用。将用含有双抗(200 u/ml)的 pbs 液反复冲洗后的乳腺组织块及操作器械放入消毒完毕的超净台中，打开风箱，点燃酒精灯。用剪、摄将乳白色乳腺腺泡组织剪出，大小约1mm3。将剪出的组织块用含有双抗的 dmem 培养液反复冲洗。将剪碎的组织块浸入含10%胎牛血清、200u/ml青链霉素的 dmem 完全培养基中，用吸管吸取组织块并将组织块紧密均匀的接种在培养瓶中。将培养瓶置于含有5% co2 的培养箱中倒置培养6h，取出，并缓慢加入少量的 dmem 完全培养基12h后加入足量的完全培养基(将组织浸没)。以后48h 换液1次，进行常规培养，待细胞密度达90%左右时纯化。
4. 研究创新点
从蛋白水平，探讨热应激对乳腺上皮细胞泌乳功能的影响。
5. 研究计划与进展
1) 2018年9月初到9月下旬 查阅相关文献，确立研究方向及内容。
预期:通过查阅文献，和老师的指导，顺利确定课题。
2) 2018年10月下旬到12月中旬 收集乳腺组织，体外培养乳腺上皮细胞。
